Control de calidad de las mediciones en Espectroscopia de absorción atómica

El siguiente artículo tiene por objetivo presentar los diferentes tipos de control de calidad que son necesarios para obtener lecturas confiables en espectroscopia de absorción atómica.

Control de la preparación de los estándares de calibración
En EAA, como en muchas técnicas en que se compara una señal versus una concentración, existen dos reglas de medidas, una regla fija, que en este caso corresponde a las absorbancias y una regla variable (que se ajusta a conveniencia en función de la primera) que corresponde a la concentración de la muestra expresada generalmente como mg/L o ug/L.
Específicamente, la que nos interesa para realizar nuestro control de calidad es la regla fija. Es decir, lo que debemos realizar es preparar soluciones estándares de calibración y contrastarla con las medidas en absorbancias, las cuales podemos obtener estadísticamente recopilando datos durante un cierto período de tiempo. Recordar que la sensibilidad (absorbancias) depende entre otras cosas de la matriz con que preparemos estas soluciones.
Ahora bien, la idea de esto, es que en la operación, cada analista prepare cada solución estándar aproximadamente de la misma manera y en forma correcta. Para esto, veamos el siguiente ejemplo.
Para preparar nuestras curvas de calibración para el elemento cobre a 324,8 nm se procedió a seguir las recomendaciones del fabricante del equipo. En este caso, se ajustó una solución 1,5 mg/L de cobre a 0,200 ua y se procedió a preparar los diferentes estándares de la curva y a obtener sus absorbancias. La siguiente tabla presenta un ejemplo de estos resultados.

Tabla 1.- Curva de calibración para el elemento cobre a 324,8 nm

Como se puede apreciar la curva de calibración no es estrictamente lineal, ya que se produce una desviación de la linealidad de aproximadamente un 5%, la cual no debería afectar la linealidad del método (cuestión que debiera demostrarse en la validación del método).

Con esto, el analista deberá preparar cada estándar de calibración y alcanzar las absorbancias que fueron definidas previamente. Para usar nuevamente estas soluciones, sólo deberá verificar que aun alcanza las tolerancias establecidas, de lo contrario deberá preparar soluciones estándares nuevos.

Control de la lectura

Para ello una recomendación es preparar un blanco y uno o dos estándares de calibración independiente de la curva o disponer de uno o dos materiales de referencia certificado. Estos deberán ser leídos de la misma forma que las muestras y deberán ser contrastados de acuerdo con su tolerancia. 

A continuación, se presenta un ejemplo del control de las lecturas en el el proceso de medición.

BK_L blanco de lectura

STD_L Estándar de lectura o MRC 

Es importante que las condiciones del equipo estén optimizadas, tales como; ajuste del flujo de gases, perfil de la llama, limpieza del mechero, cámara de pre-mezcla, nebulizador, energía de la lámpara, ajuste de la longitud de onda y slit,sistema óptico del equipo alineado y limpio, etc.

Control del volumen del material de vidrio

El volumen del material de vidrio que se usa para preparar los estándares de calibración; bureta, pipeta total, matraz de aforo, etc. deben ser calibrados de acuerdo con normas internacionales, como por ejemplo ISO 4787.
Una vez obtenido el volumen mediante constrastación con la masa, se debe proceder a aceptar o rechazar el material de vidrio de medición de acuerdo con las tolerancias establecidas por las normas ISO.
En las tablas siguientes se presentan estas tolerancias.

Tabla 2.- Capacidades, subdivisiones y error máximo permitido para buretas (ISO 385)

Tabla 3.- volumenes nominales y errores máximos permitidos para pipetas totales (ISO 648)

Tabla 4.- Dimensiones y errores máximo permitidos para matraces de aforo de cuello angosto (ISO 1042)

Si el material de vidrio no cumple con las tolerancias establecidas, entonces éste deberá ser descartado, de lo contrario podrá seguir usándose en la operación de rutina.


Referencias
ISO 4787:2010 Laboratory glassware -Volumetric instruments - Methods for testing of capacity and for use. Génova, Suiza.
ISO 385:2005 Laboratory glassware - Burettes
ISO 648:2005 Laboratory glassware - Single-volume pipettes
ISO 1042:1998 Laboratory glassware - One-mark volumetric flask

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Prueba de linealidad de una curva de calibración

Uno de los errores más comunes en la evaluación de la linealidad en las curvas de calibración es el uso exclusivo del coeficiente de regresión, r^2, para indicar si un modelo adoptado es adecuado o no. Incluso un valor de r^2 muy cercano a 1 puede conducir a conclusiones erróneas, ya que este valor puede ser obtenido también para dependencias claramente curvadas [1][2], como se aprecia en el siguiente gráfico, donde R^2 es 0,995:

El siguiente artículo está basado en el paper de Rawski y colaboradores [1] y tiene por objeto entregar una alternativa para evaluar la linealidad de las curvas de calibración.
Para ello, se propone realizar una completa evaluación estadística que incluya el test de Falta de Ajuste, el test clásico de Fisher-Snedecor, el test de IUPAC y el test de Mandel.

Diseño de las pruebas
Supongamos que se prepararon 11 soluciones de distinta concentración de un elemento y se leyeron por espectrofotometría. Con estos datos se quiere saber si el método lineal o cuadrático es adecuado o no para este rango de concentración.

Test de Falta de ajuste (Lack of Test)

Para realizar este test clásico se necesita un mínimo de repeticiones en triplicado, lo que no se requiere para los test restantes que sólo necesitan usar los promedios como respuesta. Lo que hace esta prueba es detectar si los datos se ajustan bien o débilmente al modelo de regresión adoptado (en nuestro caso lineal). Por lo tanto, el contraste de hipótesis es:

H0: Los datos se ajustan al modelo de regresión adoptado es decir, yij = axi + b
versus
HA: Los datos no se ajustan bien al modelo de regresión adoptado

Para facilitar el desarrollo de este test, sólo se necesita copiar los datos y pegarlos en un software estadístico. En nuestro ejemplo se usó Minitab.

Los resultados se muestran a continuación.

Como se puede apreciar, el valor p de falta de ajuste indica 0,000, esto significa que con un 95% de confianza se rechaza la idea de que los datos se ajusten a un modelo lineal, Veamos el análisis de residuos.

Acá se puede apreciar claramente que la relación entre las variables no se ajustan bien a un modelo de regresión lineal. Por lo tanto, se puede concluir que el modelo lineal no es adecuado.

Test Clásico de Fisher - Snedecor

Este test permite comparar la significancia de los efectos lineal y cuadrático. En el fondo, define la significancia de ambos efectos como una relación de dicho efecto y la varianza residual.

Las siguientes hipótesis están en juego:
Si F lin > F#, lin, y F cuad < F#, cuad, entonces el modelo cuadrático es adecuado.
Si F lin < F#, lin, y F cuad > F#, cuad, entonces el modelo lineal es adecuado. 

Para ello, se necesitan calcular los siguientes términos:

r² lineal = 0,9668 

SC res = 0,2212

n = 11

k = 1 (grado del polinomio lineal)

F lin = 261,7

r² cuadratico = 0,9984 

n = 11

k = 2 (grado del polinomio cuadrático)

 

F cuad = 154,7

Los valores de F obtenidos se deben comparar con los respectivos valores criticos de F (alfa; 1; n - k - 1) tomados de las tablas de distribución F.

Si la significancia del efecto es menor que el correspondiente valor crítico, entonces el efecto dado debe ser considerado como no significativo, caso contrario el modelo lineal no es apropiado. en nuestro caso, los F críticos son

F# lineal = 5,117 (0,05; 1 ;9)

F# cuad = 5,318 (0,05;1; 8)

En ambos casos, el F del estadístico de prueba es mayor que el F crítico. Por lo tanto ambos modelos son significativos.

Test de IUPAC [1][3]

La Unión Internacional de Química Pura y aplicada, IUPAC, modificó el test de Fisher-Snedecor para mejorar las conclusiones de este test, centrándose sólo en las varianzas residuales de los modelos lineal y cuadrático.
El contraste de hipótesis es:

H0: La varianza explicada por el término adicional no difiere de la varianza residual del modelo. Por lo tanto, el modelo cuadrático no es significativo.
versus
HA: La varianza explicada por el término adicional difiere de la varianza residual del modelo. Por lo tanto, el modelo cuadrático es significativo.

Se necesitan calcular los siguientes términos:



S² (ŷ lin) = 0,0008173




S² (ŷ cuad) = 4,54 x 10<sup>-5

Finalmente, el estadístico de prueba es:</sup>

F_IUPAC = 17,075

Este valor se compara con el F crítico que es F# = 5,318 (con alfa = 0,05; 1 ; n-3)

Como el F de IUPAC es mayor al F # crítico, entonces se puede concluir que el modelo lineal no es el más adecuado. ´Por lo tanto, sí lo es el modelo cuadrático.

Test de Mandel (Test IUPAC modificado)

Este test es una modificación al test de IUPAC.  El objetivo consiste en chequear si la varianza explicada por el modelo cuadrático es más grande que la varianza explicada por el modelo lineal, pero considerando la influencia de los grados de libertad.

Para ello, se necesita calcular lo siguiente:

S² (ŷ lin) = 0,0008173

S² (ŷ cuad) = 4,54 x 10<sup>-5

Luego, se calcula el estadístico de prueba F de Mandel:</sup>

F_M = 154,673

Este valor se compara con el F crítico que es F# = 5,318 (con alfa = 0,05; 1 ; n-3)

Como el F de Mandel es mayor al F # crítico, entonces se puede concluir que el modelo lineal no es el más adecuado. ´Por lo tanto, sí lo es el modelo cuadrático.

Otra forma de contrastar esta hipótesis es convirtiendo el puntaje F experimental en p-valor.

En Excel se coloca;

=distr.F(F_M;grados de libertad numerador;grados de libertad denominador) 

o en nuestro caso:

=distr.F(154,673;1;8)

El resultado es 

p-valor = 1,63E-06

Como p-valor es menor a alfa= 0,05, entonces se rechaza la Hipótesis nula con un 95 % de confianza. Por lo tanto, se puede concluir que el modelo lineal no es adecuado. 

Conclusión general

La siguiente tabla muestra el resumen de los resultados:

N°	Test	Resultados
1	Falta de ajuste	El modelo lineal da un débil ajuste
2	Fisher-Snedecor	El modelo lineal es significativo El modelo cuadrático es significativo
3	IUPAC	El modelo cuadrático es válido
4	Mandel	El modelo cuadrático es válido

Referencias
[1] Rawski, Sanecki, Kijowska, Skital, Saletnik. "Regression Analysis in Analytical Chemistry, Determination and Validation of Linear and Quadratic Regression Dependencies". S. Afr. J. Chem. 2016, 69, 166-173.
[2] Van Loco, "Linearity of calibration curves: use and misuse of the correlation coefficient, Accred Qual Assur (2002) 7:281–285.
[3] IUPAC, Danzer and Currie "Guidelines for Calibration in Analytical Chemistry". Pure &Appl. Chem., Vol. 70, No. 4, pp. 993-1014, 1998.
[4] Curso de validación de metodologías de Mauricio Arancibia G.

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