Derivación de la ecuación de la incertidumbre asociada a la calibración lineal para EAA e ICP

Las fuentes de incertidumbre relacionadas con la curva de calibración en los métodos instrumentales incluyen la incertidumbre asociada a las respuestas, la incertidumbre debido a los estándares de calibración y la incertidumbre asociada a la pendiente, las cuales se presentan en la siguiente expresión condensada:

 

donde:

C0: concentración determinada del elemento de interés

Sx/y ; desviación estándar de los residuos

b: pendiente de la curva de calibración

m: número de respuestas (n x número de repeticiones)

n: número de estándares de calibración

C barra: valor medio de los distintos estándares de calibración 

Sxx: componente de las concentraciones respecto del valor medio

Esta ecuación es muy importante para este tipo de técnicas. Pero muchos desconocen como se deriva esta expresión. De esto se trata este artículo, mostrar como se origina la ecuación de la incertidumbre asociada a la calibración lineal para métodos instrumentales.

Partamos de la base que la curva de calibración debe ser una recta de la forma :

Y =  a + bX

donde Y: es la respuesta
a: es el intercepto de la curva
b: es la pendiente
X: es la concentración.

Si ajustamos esta expresión a los datos, entonces podemos obtener la siguiente expresión:

(1)

donde a sombrero y b sombrero son los estimadores del intercepto y la pendiente respectivamente y ei es el componente aleatorio de la i-ésima respuesta.
Hay que tomar en cuenta que este método de ajuste conocido como "ajuste de mínimos cuadrados" parte de tres supuestos:
    a) los datos se ajustan a un modelo lineal
    b) los errores sólo ocurren en y
    c) Los errores son normalmente distribuidos y son independientes del valor de x e independientes entre sí.

Ahora bien, si despejamos la concentración en la ecuación (1), obtenemos:

Pero, calcular la incertidumbre a esta expresión resulta un poco más complejo, porque a y b se encuentran correlacionadas. Por lo tanto, podemos usar una alternativa que es la expresión de la pendiente, la cual contiene prácticamente los mismos términos.
Recordemos que la pendiente b es de la forma:

(2)

Si despejamos la concentración, tenemos:

(3)

A esta expresión necesitamos calcular la incertidumbre total, la cual corresponde a la suma de las incertidumbres de todos sus componentes, es decir:

(4)

Pero sabemos que la componente x (que es la concentración) la consideramos fijo, por lo tanto

Y tenemos que:

(5)

Para ajustar linealmente los datos usamos el teorema de Taylor.

Recordar que el teorema de Taylor es de la forma:

donde a es una constante.

Por lo tanto, para calcular las incertidumbres, solo necesitamos calcular sólo aquellos términos de primer orden del Teorema y usar las propiedades de las varianzas según la función de la ecuación (5) :

(6)

Resolviendo las derivadas de la expresión (3):
                                                       
tenemos:

reemplazando en (6)

(7)

(8)

Considerando las varianzas:

y reemplazando en la ecuación (6), tenemos:

(9)

(10)

Por lo tanto, la incertidumbre asociada a la curva de calibración será:

(11)

Sin embargo, la pendiente b es igual a:

reemplazando en (11), tenemos:

(12)

Si hacemos los siguientes términos:

Entonces, obtenemos la expresión final de la incertidumbre de la curva de calibración:

Referencias:

(1) Hibbert David, "The uncertainty of a result from a linear calibration. The Analyst, January 2007.

(2) Myers, Well - Research Design and Statistical Analysis - 2Ed 2003

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Estimación de la precisión mediante estadístico de Howarth-Thompson

El control de calidad de los laboratorios, tanto externos como internos, resulta vital para asegurar los resultados analíticos con las cuales se deben tomar decisiones respecto de sus procesos.
Uno de esos controles y del cual es el objetivo del presente artículo es el control de la variabilidad de los resultados.

Esta variabilidad puede medirse de diversas maneras y utilizando diferentes estadísticos (rango, desviación estándar, varianza, error relativo, coeficiente de variación, varianza relativa, etc.)

Howarth y Thompson en 1973 propusieron el siguiente esquema de trabajo para controlar la precisión de los laboratorios, donde la precisión se expresa mediante el coeficiente de variación, también conocido como desviación estándar relativa (RSD en inglés).

Construcción del estadístico de Howarth-Thompson

El estadístico de Howarth - Thompson está desarrollado para análisis en duplicados. Y en base al trabajo desarrollado por estos autores, se llegó a obtener una curva de precisión que es una hipérbola de forma:

Ahora bien, el Coeficiente de variación, por definición corresponde a:

CV = s/c (1.1)

La precisión expresada con un nivel de probabilidad del 95 % es:

CV = 2s/c (1.2)

Otra forma de denotarlo es:

(1.3)

Donde

P = Precisión, expresada como coeficiente de variación porcentual (CV%) con un nivel de probabilidad del 95%.

s = desviación estándar
c = concentración media entre duplicados

La desviación estándar, s, que es función de la concentración se estima a partir de la Mediana de las diferencias absolutas (abs diff) entre duplicados cada 11 muestras.

Pero la desviación estándar de la concentración es:
Sc = kc + S0 (1.4)

que se desprende de la curva de regresión del siguiente gráfico.

k es la pendiente de la curva de regresión y S0 es es el intercepto.

Por lo tanto, despejando (1.4) en (1.3), tenemos:

(1.5)

(1.6)

que corresponde al estadístico de precisión Howarth-Thompson

Una forma equivalente de expresar este estadístico, pero expresado con un nivel de probabilidad del 99,73% es:

Pc = 3So/c + LR (1.7)

donde LR es el límite de repetibilidad que es igual a:

LR = 3K  (1.8)

Procedimiento de validación

Para N > 50 duplicados
a) Los duplicados se ordenan de menor a mayor
b) Se calcula la media y las diferencias absolutas de cada uno
c) Se calculan las media de las medias y las medianas de las diferencias absolutas cada 11 duplicados.
d) Se calcula la pendiente, m, y el intercepto, s₀.
e) Se calcula el límite de detección de acuerdo a la siguiente expresión:

(1.9)

f) Se calcula el Estadístico de H-T, Pc, de acuerdo a la expresión (1.6) o (1.5)
g) Se borran todos los datos bajo el límite de detección.
h) Se grafica este estadístico, Pc vs la concentración.

Esta curva corresponde a línea de control de la precisión estimada con un nivel de probabilidad del 95%


Procedimiento de Control de calidad mediante el estadístico H-T para muestras en duplicados (corregido)

Una vez realizada la validación, se efectúa el control de calidad de las muestras en duplicados en la cual se pueden considerar las siguientes expresiones:

La cual corresponde al error relativo en porcentaje

la cual corresponde a la mitad del error relativo.

A continuación, se muestra un ejemplo de este criterio:

Aquí se puede apreciar que el criterio HARD es menos exigente.

Los mismos datos, pero graficados en Excel usando el criterio HARD.

Fuente: 

[1] Michael Thompson y Richard J. Howarth. The Rapid Estimation and Control of Precision by Duplicate Determination. The Analist, Marzo de 1973.

[2] Michael Thompson y Richard J. Howarth. Duplicate Analysis in Geochemical Practice - Part 1. Theoretical Approach and Estimation of Analytical Reproducibility. Awalyst, September, 1976, Vol. 101, pp. 690-698

[3] Marat Abzalov (2011). Sampling Errors and Control of Assay Data Quality in Exploration and Mining Geology, Applications and Experiences of Quality Control, Prof. Ognyan Ivanov (Ed.), ISBN: 978-953-307-236-4

[4] Bumstead, E.D. (1984). Some comments on the precision and accuracy of gold analysis exploration. Proceedings AusIMM, No. 289, p.71-78, ISSN 1034-6783

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Prueba de linealidad de una curva de calibración

Uno de los errores más comunes en la evaluación de la linealidad en las curvas de calibración es el uso exclusivo del coeficiente de regresión, r^2, para indicar si un modelo adoptado es adecuado o no. Incluso un valor de r^2 muy cercano a 1 puede conducir a conclusiones erróneas, ya que este valor puede ser obtenido también para dependencias claramente curvadas [1][2], como se aprecia en el siguiente gráfico, donde R^2 es 0,995:

El siguiente artículo está basado en el paper de Rawski y colaboradores [1] y tiene por objeto entregar una alternativa para evaluar la linealidad de las curvas de calibración.
Para ello, se propone realizar una completa evaluación estadística que incluya el test de Falta de Ajuste, el test clásico de Fisher-Snedecor, el test de IUPAC y el test de Mandel.

Diseño de las pruebas
Supongamos que se prepararon 11 soluciones de distinta concentración de un elemento y se leyeron por espectrofotometría. Con estos datos se quiere saber si el método lineal o cuadrático es adecuado o no para este rango de concentración.

Test de Falta de ajuste (Lack of Test)

Para realizar este test clásico se necesita un mínimo de repeticiones en triplicado, lo que no se requiere para los test restantes que sólo necesitan usar los promedios como respuesta. Lo que hace esta prueba es detectar si los datos se ajustan bien o débilmente al modelo de regresión adoptado (en nuestro caso lineal). Por lo tanto, el contraste de hipótesis es:

H0: Los datos se ajustan al modelo de regresión adoptado es decir, yij = axi + b
versus
HA: Los datos no se ajustan bien al modelo de regresión adoptado

Para facilitar el desarrollo de este test, sólo se necesita copiar los datos y pegarlos en un software estadístico. En nuestro ejemplo se usó Minitab.

Los resultados se muestran a continuación.

Como se puede apreciar, el valor p de falta de ajuste indica 0,000, esto significa que con un 95% de confianza se rechaza la idea de que los datos se ajusten a un modelo lineal, Veamos el análisis de residuos.

Acá se puede apreciar claramente que la relación entre las variables no se ajustan bien a un modelo de regresión lineal. Por lo tanto, se puede concluir que el modelo lineal no es adecuado.

Test Clásico de Fisher - Snedecor

Este test permite comparar la significancia de los efectos lineal y cuadrático. En el fondo, define la significancia de ambos efectos como una relación de dicho efecto y la varianza residual.

Las siguientes hipótesis están en juego:
Si F lin > F#, lin, y F cuad < F#, cuad, entonces el modelo cuadrático es adecuado.
Si F lin < F#, lin, y F cuad > F#, cuad, entonces el modelo lineal es adecuado. 

Para ello, se necesitan calcular los siguientes términos:

r² lineal = 0,9668 

SC res = 0,2212

n = 11

k = 1 (grado del polinomio lineal)

F lin = 261,7

r² cuadratico = 0,9984 

n = 11

k = 2 (grado del polinomio cuadrático)

 

F cuad = 154,7

Los valores de F obtenidos se deben comparar con los respectivos valores criticos de F (alfa; 1; n - k - 1) tomados de las tablas de distribución F.

Si la significancia del efecto es menor que el correspondiente valor crítico, entonces el efecto dado debe ser considerado como no significativo, caso contrario el modelo lineal no es apropiado. en nuestro caso, los F críticos son

F# lineal = 5,117 (0,05; 1 ;9)

F# cuad = 5,318 (0,05;1; 8)

En ambos casos, el F del estadístico de prueba es mayor que el F crítico. Por lo tanto ambos modelos son significativos.

Test de IUPAC [1][3]

La Unión Internacional de Química Pura y aplicada, IUPAC, modificó el test de Fisher-Snedecor para mejorar las conclusiones de este test, centrándose sólo en las varianzas residuales de los modelos lineal y cuadrático.
El contraste de hipótesis es:

H0: La varianza explicada por el término adicional no difiere de la varianza residual del modelo. Por lo tanto, el modelo cuadrático no es significativo.
versus
HA: La varianza explicada por el término adicional difiere de la varianza residual del modelo. Por lo tanto, el modelo cuadrático es significativo.

Se necesitan calcular los siguientes términos:



S² (ŷ lin) = 0,0008173




S² (ŷ cuad) = 4,54 x 10<sup>-5

Finalmente, el estadístico de prueba es:</sup>

F_IUPAC = 17,075

Este valor se compara con el F crítico que es F# = 5,318 (con alfa = 0,05; 1 ; n-3)

Como el F de IUPAC es mayor al F # crítico, entonces se puede concluir que el modelo lineal no es el más adecuado. ´Por lo tanto, sí lo es el modelo cuadrático.

Test de Mandel (Test IUPAC modificado)

Este test es una modificación al test de IUPAC.  El objetivo consiste en chequear si la varianza explicada por el modelo cuadrático es más grande que la varianza explicada por el modelo lineal, pero considerando la influencia de los grados de libertad.

Para ello, se necesita calcular lo siguiente:

S² (ŷ lin) = 0,0008173

S² (ŷ cuad) = 4,54 x 10<sup>-5

Luego, se calcula el estadístico de prueba F de Mandel:</sup>

F_M = 154,673

Este valor se compara con el F crítico que es F# = 5,318 (con alfa = 0,05; 1 ; n-3)

Como el F de Mandel es mayor al F # crítico, entonces se puede concluir que el modelo lineal no es el más adecuado. ´Por lo tanto, sí lo es el modelo cuadrático.

Otra forma de contrastar esta hipótesis es convirtiendo el puntaje F experimental en p-valor.

En Excel se coloca;

=distr.F(F_M;grados de libertad numerador;grados de libertad denominador) 

o en nuestro caso:

=distr.F(154,673;1;8)

El resultado es 

p-valor = 1,63E-06

Como p-valor es menor a alfa= 0,05, entonces se rechaza la Hipótesis nula con un 95 % de confianza. Por lo tanto, se puede concluir que el modelo lineal no es adecuado. 

Conclusión general

La siguiente tabla muestra el resumen de los resultados:

N°	Test	Resultados
1	Falta de ajuste	El modelo lineal da un débil ajuste
2	Fisher-Snedecor	El modelo lineal es significativo El modelo cuadrático es significativo
3	IUPAC	El modelo cuadrático es válido
4	Mandel	El modelo cuadrático es válido

Referencias
[1] Rawski, Sanecki, Kijowska, Skital, Saletnik. "Regression Analysis in Analytical Chemistry, Determination and Validation of Linear and Quadratic Regression Dependencies". S. Afr. J. Chem. 2016, 69, 166-173.
[2] Van Loco, "Linearity of calibration curves: use and misuse of the correlation coefficient, Accred Qual Assur (2002) 7:281–285.
[3] IUPAC, Danzer and Currie "Guidelines for Calibration in Analytical Chemistry". Pure &Appl. Chem., Vol. 70, No. 4, pp. 993-1014, 1998.
[4] Curso de validación de metodologías de Mauricio Arancibia G.

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